本发明涉及生物技术领域，尤其是一种β-法尼烯的生产方法。

背景技术：

β-法尼烯是一种重要的倍半稀萜类化合物，其在很多领域有着广泛的应用前景，一方面，维生素E生产领域，β-法尼烯作为中间体能够极大的减少了维生素E的合成步骤，与传统合成方法相比提高了反应效率和收率，降低生产成本，目前湖北能特科技已经利用β-法尼烯进行维生素E的生产；另一方面，β-法尼烯可用于制备高热值、高效能的清洁可再生燃料，缓解全球能源危机，目前美国Amyris已经利用专利酵母菌进行β-法尼烯的生产，但其以蔗糖为主要原料，生产成本相对昂贵，发酵周期长，本技术利用价格低廉糖蜜为主要原料，利用重组大肠杆菌作为生产菌种生产β-法尼烯，缩短了发酵周期，降低了生产成本。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种β-法尼烯的生产方法，利用价格低廉糖蜜为主要原料，利用重组大肠杆菌作为生产菌种生产β-法尼烯，缩短了发酵周期，降低了生产成本。

本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：

一种β-法尼烯的生产方法，包括如下步骤：S1糖蜜除杂纯化、S2β-法尼烯重组宿主细胞的构建、S3将重组宿主细胞接种到含有除杂纯化后的糖蜜的培养基中进行异源诱导表达合成β-法尼烯、S4通过发酵控制提高β-法尼烯的产量。

优选的，所述步骤S1具体包括：

（1）称量：称取糖蜜原液加入1.5-2.0倍的水，将糖蜜稀释至16-17波美度，得稀糖液，每批次糖蜜原液质量均有波动，稀释水量根据现场用波美度计测定的数据为准；

（2）酸化：稀糖液倒入发酵罐中，加入浓硫酸及浓磷酸调整酸度，pH4.0-4.5，进行酸化，酸化后，沙土、浮渣等杂质≤1%，浓度≥80°BX，全糖分≥52%，酸度＜9%；

（3）通风：通蒸汽加热煮沸酸化后的稀糖液，加热促使胶体蛋白凝固，便于沉淀离心，加热煮沸后，保温90℃，同时通入进罐空气1h，以去除有害气体NO2、SO2等有害气体以及挥发性酸和其它挥发性物质；

（4）加碱中和：通风处理后的稀糖液装入暂存桶，加入石灰乳调节pH至5.0-5.5，石灰乳由氧化钙加水配得，现用现配；

（5）离心澄清：用高速离心机离心除去加碱中和后的稀糖液中的杂质，取清液；

（6）加热灭菌：清液倒入清洗干净的发酵罐中，通汽加热至90℃，保温0.5h；

（7）保压存放：灭菌好后将发酵罐密闭，通气保压1.0Mpa，常温暂存备用。

优选的，所述步骤S2具体包括：（1）通过NCBI数据库查询和基因工程技术手段获得合成β-法尼烯的相关基因，相关基因包括甲羟戊酸途径中乙酰乙酰基CoA硫解酶（AtoB）基因atoB、HMG-CoA合酶（ERG13）基因erg13、HMG-CoA还原酶（tHMG1）基因thmg1、甲羟戊酸激酶（ERG12）基因erg12、磷酸甲羟戊酸激酶（ERG8）基因erg8、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶（MVD1）基因mvd1、异戊烯焦磷酸异构酶（IDI）基因idi、法尼基焦磷酸合成酶（FPPS）基因ispA、法尼烯合酶（AFS）基因afs；

（2）构建在同一宿主细胞中兼容的多重重组质粒，所述多重重组质粒在宿主细胞中通过启动子转录和宿主细胞翻译共表达合成β-法尼烯的相关蛋白；

（3）多重重组质粒转化导入到宿主细胞中获得合成β-法尼烯的重组宿主细胞。

优选的，所述步骤S3具体包括：将重组宿主细胞进行活化并接入250mL装有LB培养基（胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g、用水定容到1000mL）的三角瓶中培养，摇床温度30-38℃，转速180-220r/min，培养至OD600到0.8±0.2，以3-20%的接种量接入1000mL二级发酵摇瓶培养，摇床温度35-38℃，转速180-250r/min，培养至OD600到1.2±0.2，以5%-8%的接种量接入30L发酵罐发酵培养。

优选的，所述步骤S4具体包括：整个发酵过程通风量控制在0.5vvm-1.5vvm，发酵罐搅拌转速控制在200r/min-400r/min，发酵液溶氧量控制在2%-90%，pH为7.0±0.4（用20%硫酸和30%氨水控制发酵液pH）；发酵前期（0h-20h）发酵温度为35℃-37℃，发酵中期（21h-48h）发酵温度为30℃-35℃，发酵后期（49h-结束）为28℃-35℃；当培养至OD600为8-20，向发酵培养基中接入终浓度为0.1-0.5mmol/L异丙基硫代半乳糖苷（IPTG），2h-10h小时后接入占发酵液体积10%-20%的萃取剂，所述萃取剂为正癸烷、正十二烷、石油醚、正辛烷中的一种或多种；发酵过程中当糖浓度（°BX）下降到（4±1）%时开始补料，控制发酵液中糖浓度（°BX）在4.0±0.2。

优选的，所述糖蜜原液中的糖蜜为甘蔗糖蜜或甜菜糖蜜或两者的组合，组合情况下，甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜的重量比为100:25-1000。

优选的，所述宿主细胞为大肠杆菌，重组宿主细胞为大肠杆菌B21，构建的重组宿主细胞大肠杆菌B21能够表达乙酰乙酰基CoA硫解酶（AtoB）、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶、法尼基焦磷酸合成酶和法尼烯合酶共9种酶，其中，基因atoB的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，基因erg13的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，基因thmg1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，基因erg12的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，基因erg8的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，基因mvd1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，基因idi的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，基因ispA的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，基因afs的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

优选的，重组宿主细胞大肠杆菌B21，包含pKK223-3、PMCSG9、pMal-c4X三种质粒，其中pKK223-3上包含atoB、thmg1、mvd1三种基因，PMCSG9上包含erg13、erg12、erg8、ispA四种基因，pMal-c4X上包含idi、afs两种基因。

优选的，所述质粒pKK223-3选用tac启动子（如SEQ ID NO.1所示）、质粒PMCSG9选用T7启动子（如SEQ ID NO.2所示）、质粒pMal-c4X选用tac启动子（如SEQ ID NO.3所示）。

优选的，所述二级发酵摇瓶培养和30L发酵罐发酵培养过程中，培养基的主要组成如下：除杂纯化后的糖蜜占培养基比重2%-20%，酵母粉或者酵母膏或两者的组合（组合情况下酵母粉：酵母膏为100:1-10000），占培养基比重1%-10%、蛋白胨占培养基比重1.5%-8.5%、柠檬酸铵占培养基比重0.1%-5%、硫酸镁或氯化镁占培养基比重0.1%-2%，硫酸锰占培养基比重0.05%-0.9%，硫酸锌占培养基比重0.02%-0.8%。

优选的，所述补料过程中补充的物料重量百分比为除杂纯化后的糖蜜40%-60%，硫酸铵20%-50%，蛋白胨5%-10%，上述物料于110-120℃高压灭菌25-40min备用。

一种气相色谱法检测发酵液中β-法尼烯的方法，包括如下步骤：

H1、发酵液前处理：取10mL以上发酵液，9000-12000r/min离心3-8min，油相和水相分层，吸取上层油相，用0.44um有机滤膜过滤，得到滤出液；

H2、使用安捷伦7890A气相色谱仪，19091JHP-5色谱柱(柱长30m;内径0.32mm;膜厚250um)，配置β-法尼烯系列标准溶液，制成浓度分别为5g/L、10g/L、15g/L、20g/L的β-法尼烯标准溶液，分别进样检测，绘制线性回归方程，并计算R值，使R值在99%以上，上述β-法尼烯检测条件为：柱箱温度：初始温度65-75℃，保留2min，以10℃/min升至220-280℃,保留1min，进样口温度220-280℃，进样量1uL，品注入分流比1:50，检测器（FID）温度260-280℃，氮气作为载气，入口压力是12-18psi，模式为恒流模式。

本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明的一种β-法尼烯的生产方法，利用价格低廉糖蜜为主要原料，利用重组大肠杆菌作为生产菌种生产β-法尼烯，缩短了发酵周期，降低了生产成本，经本发明的一种气相色谱法检测发酵液中β-法尼烯的方法检测，发酵72小时后，发酵液中β-法尼烯浓度高达20.5g/L。

具体实施方式

实施例1 一种β-法尼烯的生产方法

一种β-法尼烯的生产方法，包括如下步骤：S1糖蜜除杂纯化、S2β-法尼烯重组宿主细胞的构建、S3将重组宿主细胞接种到含有除杂纯化后的糖蜜的培养基中进行异源诱导表达合成β-法尼烯、S4通过发酵控制提高β-法尼烯的产量。

所述步骤S1具体包括：

（1）称量：称取糖蜜原液加入1.5-2.0倍的水，将糖蜜稀释至16-17波美度，得稀糖液；

（2）酸化：稀糖液倒入发酵罐中，加入浓硫酸及浓磷酸调整酸度，pH4.0-4.5，进行酸化，酸化后，沙土、浮渣等杂质≤1%，浓度≥80°BX，全糖分≥52%，酸度＜9%；

（3）通风：通蒸汽加热煮沸酸化后的稀糖液，加热促使胶体蛋白凝固，便于沉淀离心，加热煮沸后，保温90℃，同时通入进罐空气1h，以去除有害气体NO2、SO2等有害气体以及挥发性酸和其它挥发性物质；

（4）加碱中和：通风处理后的稀糖液装入暂存桶，加入石灰乳调节pH至5.0-5.5，石灰乳由氧化钙加水配得，现用现配；

（5）离心澄清：用高速离心机离心除去加碱中和后的稀糖液中的杂质，取清液；

（6）加热灭菌：清液倒入清洗干净的发酵罐中，通汽加热至90℃，保温0.5h；

（7）保压存放：灭菌好后将发酵罐密闭，通气保压1.0Mpa，常温暂存备用。

所述步骤S2具体包括：

（1）通过NCBI数据库BLAST找到MVA途径中的乙酰乙酰基CoA硫解酶（AtoB）、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶、法尼基焦磷酸合成酶和法尼烯合酶共9种酶以及对应的cDNA序列；

（2）构建在同一宿主细胞中兼容的多重重组质粒，即：根据已知酶的cDNA序列设计引物合成相应的基因序列，以设计合成的cDNA序列为模板通过PCR技术克隆合成相应的基因序列，运用DNA重组技术，将克隆合成基因序列连接到相应的质粒上，形成多重重组质粒，多重重组质粒在宿主细胞中通过启动子转录和宿主细胞翻译共表达合成β-法尼烯的相关蛋白；

（3）多重重组质粒转化导入到宿主细胞中获得合成β-法尼烯的重组宿主细胞，即：将连接好的重组质粒导入大肠杆菌宿主细胞，培养扩增重组宿主细胞，提取质粒进行测序验证目的基因已经连接到相应的质粒上，将验证后的菌株进行培养保藏。

所述步骤S3具体包括：将重组宿主细胞进行活化并接入250mL装有LB培养基（胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g、用水定容到1000mL）的三角瓶中培养，摇床温度37℃，转速200r/min，培养至OD600到0.8±0.2，以10%的接种量接入1000mL二级发酵摇瓶培养，摇床温度37℃，转速220r/min，培养至OD600到1.2±0.2，以7%的接种量接入30L发酵罐发酵培养。

所述步骤S4具体包括：整个发酵过程通风量控制在0.8vvm，发酵罐搅拌转速控制在300r/min，发酵液溶氧量控制在20%，pH为7.0±0.4（用20%硫酸和30%氨水控制发酵液pH）；发酵前期（0h-20h）发酵温度为36℃，发酵中期（21h-48h）发酵温度为32℃，发酵后期（49h-72h）为30℃；当培养至OD600为16，向发酵培养基中接入终浓度为0.1mmol/L异丙基硫代半乳糖苷（IPTG），3h小时后接入占发酵液体积15%的萃取剂，所述萃取剂为正十二烷；发酵过程中当糖浓度（°BX）下降到（4±1）%时开始补料，控制发酵液中糖浓度（°BX）在4.0±0.2。

所述糖蜜原液中的糖蜜为甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜两者的组合，甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜的重量比为2.5:6。

所述宿主细胞为大肠杆菌，重组宿主细胞为大肠杆菌B21，构建的重组宿主细胞大肠杆菌B21能够表达乙酰乙酰基CoA硫解酶（AtoB）、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶、法尼基焦磷酸合成酶和法尼烯合酶共9种酶；重组宿主细胞大肠杆菌B21，包含pKK223-3、PMCSG9、pMal-c4X三种质粒，其中pKK223-3上包含atoB、thmg1、mvd1三种基因，PMCSG9上包含erg13、erg12、erg8、ispA四种基因，pMal-c4X上包含idi、afs两种基因；所述质粒pKK223-3选用tac启动子、质粒PMCSG9选用T7启动子、质粒pMal-c4X选用tac启动子。

所述二级发酵摇瓶培养和30L发酵罐发酵培养过程中，培养基的主要组成如下：除杂纯化后的糖蜜占培养基比重8.5%，酵母粉3.5%、蛋白胨占培养基比重4.8%、柠檬酸铵占培养基比重1.8%、硫酸镁占培养基比重1.5%，硫酸锰占培养基比重0.12%，硫酸锌占培养基比重0.08%。

所述补料过程中补充的物料重量百分比为除杂纯化后的糖蜜50%，硫酸铵30%，蛋白胨20%，上述物料于110-120℃高压灭菌25-40min备用。

实施例2 一种β-法尼烯的生产方法

一种β-法尼烯的生产方法，包括如下步骤：S1糖蜜除杂纯化、S2β-法尼烯重组宿主细胞的构建、S3将重组宿主细胞接种到含有除杂纯化后的糖蜜的培养基中进行异源诱导表达合成β-法尼烯、S4通过发酵控制提高β-法尼烯的产量。

所述步骤S1具体包括：

（1）称量：称取糖蜜原液加入1.5-2.0倍的水，将糖蜜稀释至16-17波美度，得稀糖液；

（2）酸化：稀糖液倒入发酵罐中，加入浓硫酸及浓磷酸调整酸度，pH4.0-4.5，进行酸化，酸化后，沙土、浮渣等杂质≤1%，浓度≥80°BX，全糖分≥52%，酸度＜9%；

（3）通风：通蒸汽加热煮沸酸化后的稀糖液，加热促使胶体蛋白凝固，便于沉淀离心，加热煮沸后，保温90℃，同时通入进罐空气1h，以去除有害气体NO2、SO2等有害气体以及挥发性酸和其它挥发性物质；

（4）加碱中和：通风处理后的稀糖液装入暂存桶，加入石灰乳调节pH至5.0-5.5，石灰乳由氧化钙加水配得，现用现配；

（5）离心澄清：用高速离心机离心除去加碱中和后的稀糖液中的杂质，取清液；

（6）加热灭菌：清液倒入清洗干净的发酵罐中，通汽加热至90℃，保温0.5h；

（7）保压存放：灭菌好后将发酵罐密闭，通气保压1.0Mpa，常温暂存备用。

所述步骤S2具体包括：

（1）通过NCBI数据库BLAST找到MVA途径中的乙酰乙酰基CoA硫解酶（AtoB）、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶、法尼基焦磷酸合成酶和法尼烯合酶共9种酶以及对应的cDNA序列；

（2）构建在同一宿主细胞中兼容的多重重组质粒，即：根据已知酶的cDNA序列设计引物合成相应的基因序列，以设计合成的cDNA序列为模板通过PCR技术克隆合成相应的基因序列，运用DNA重组技术，将克隆合成基因序列连接到相应的质粒上，形成多重重组质粒，多重重组质粒在宿主细胞中通过启动子转录和宿主细胞翻译共表达合成β-法尼烯的相关蛋白；

（3）多重重组质粒转化导入到宿主细胞中获得合成β-法尼烯的重组宿主细胞，即：将连接好的重组质粒导入大肠杆菌宿主细胞，培养扩增重组宿主细胞，提取质粒进行测序验证目的基因已经连接到相应的质粒上，将验证后的菌株进行培养保藏。

所述步骤S3具体包括：将重组宿主细胞进行活化并接入250mL装有LB培养基（胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g、用水定容到1000mL）的三角瓶中培养，摇床温度35℃，转速180r/min，培养至OD600到0.8±0.2，以5%的接种量接入1000mL二级发酵摇瓶培养，摇床温度35℃，转速180r/min，培养至OD600到1.2±0.2，以5%的接种量接入30L发酵罐发酵培养。

所述步骤S4具体包括：整个发酵过程通风量控制在0.5vvm，发酵罐搅拌转速控制在200r/min，发酵液溶氧量控制在10%，pH为7.0±0.4（用20%硫酸和30%氨水控制发酵液pH）；发酵前期（0h-20h）发酵温度为35℃，发酵中期（21h-48h）发酵温度为30℃，发酵后期（49h-72h）为28℃；当培养至OD600为10，向发酵培养基中接入终浓度为0.1mmol/L异丙基硫代半乳糖苷（IPTG），2h小时后接入占发酵液体积10%的萃取剂，所述萃取剂为正癸烷；发酵过程中当糖浓度（°BX）下降到（4±1）%时开始补料，控制发酵液中糖浓度（°BX）在4.0±0.2。

所述糖蜜原液中的糖蜜为甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜两者的组合，甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜的重量比为2.5:6。

所述宿主细胞为大肠杆菌，重组宿主细胞为大肠杆菌B21，构建的重组宿主细胞大肠杆菌B21能够表达乙酰乙酰基CoA硫解酶（AtoB）、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶、法尼基焦磷酸合成酶和法尼烯合酶共9种酶；重组宿主细胞大肠杆菌B21，包含pKK223-3、PMCSG9、pMal-c4X三种质粒，其中pKK223-3上包含atoB、thmg1、mvd1三种基因，PMCSG9上包含erg13、erg12、erg8、ispA四种基因，pMal-c4X上包含idi、afs两种基因；所述质粒pKK223-3选用tac启动子、质粒PMCSG9选用T7启动子、质粒pMal-c4X选用tac启动子。

所述二级发酵摇瓶培养和30L发酵罐发酵培养过程中，培养基的主要组成如下：除杂纯化后的糖蜜占培养基比重5%，酵母粉2%、蛋白胨占培养基比重2%、檬酸铵占培养基比重1%、硫酸镁占培养基比重0.5%，硫酸锰占培养基比重0.08%，硫酸锌占培养基比重0.1%。

所述补料过程中补充的物料重量百分比为除杂纯化后的糖蜜55%，硫酸铵40%，蛋白胨5%，上述物料于110-120℃高压灭菌25-40min备用。

实施例3 一种β-法尼烯的生产方法

一种β-法尼烯的生产方法，包括如下步骤：S1糖蜜除杂纯化、S2β-法尼烯重组宿主细胞的构建、S3将重组宿主细胞接种到含有除杂纯化后的糖蜜的培养基中进行异源诱导表达合成β-法尼烯、S4通过发酵控制提高β-法尼烯的产量。

所述步骤S1具体包括：

（1）称量：称取糖蜜原液加入1.5-2.0倍的水，将糖蜜稀释至16-17波美度，得稀糖液；

（2）酸化：稀糖液倒入发酵罐中，加入浓硫酸及浓磷酸调整酸度，pH4.0-4.5，进行酸化，酸化后，沙土、浮渣等杂质≤1%，浓度≥80°BX，全糖分≥52%，酸度＜9%；

（3）通风：通蒸汽加热煮沸酸化后的稀糖液，加热促使胶体蛋白凝固，便于沉淀离心，加热煮沸后，保温90℃，同时通入进罐空气1h，以去除有害气体NO2、SO2等有害气体以及挥发性酸和其它挥发性物质；

（4）加碱中和：通风处理后的稀糖液装入暂存桶，加入石灰乳调节pH至5.0-5.5，石灰乳由氧化钙加水配得，现用现配；

（5）离心澄清：用高速离心机离心除去加碱中和后的稀糖液中的杂质，取清液；

（6）加热灭菌：清液倒入清洗干净的发酵罐中，通汽加热至90℃，保温0.5h；

（7）保压存放：灭菌好后将发酵罐密闭，通气保压1.0Mpa，常温暂存备用。

所述步骤S2具体包括：

（1）通过NCBI数据库BLAST找到MVA途径中的乙酰乙酰基CoA硫解酶（AtoB）、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶、法尼基焦磷酸合成酶和法尼烯合酶共9种酶以及对应的cDNA序列；

（2）构建在同一宿主细胞中兼容的多重重组质粒，即：根据已知酶的cDNA序列设计引物合成相应的基因序列，以设计合成的cDNA序列为模板通过PCR技术克隆合成相应的基因序列，运用DNA重组技术，将克隆合成基因序列连接到相应的质粒上，形成多重重组质粒，多重重组质粒在宿主细胞中通过启动子转录和宿主细胞翻译共表达合成β-法尼烯的相关蛋白；

（3）多重重组质粒转化导入到宿主细胞中获得合成β-法尼烯的重组宿主细胞，即：将连接好的重组质粒导入大肠杆菌宿主细胞，培养扩增重组宿主细胞，提取质粒进行测序验证目的基因已经连接到相应的质粒上，将验证后的菌株进行培养保藏。

所述步骤S3具体包括：将重组宿主细胞进行活化并接入250mL装有LB培养基（胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g、用水定容到1000mL）的三角瓶中培养，摇床温度38℃，转速220r/min，培养至OD600到0.8±0.2，以20%的接种量接入1000mL二级发酵摇瓶培养，摇床温度38℃，转速250r/min，培养至OD600到1.2±0.2，以8%的接种量接入30L发酵罐发酵培养。

所述步骤S4具体包括：整个发酵过程通风量控制在1.2vvm，发酵罐搅拌转速控制在400r/min，发酵液溶氧量控制在50%，pH为7.0±0.4（用20%硫酸和30%氨水控制发酵液pH）；发酵前期（0h-20h）发酵温度为37℃，发酵中期（21h-48h）发酵温度为35℃，发酵后期（49h-72h）为30℃；当培养至OD600为20，向发酵培养基中接入终浓度为0.3mmol/L异丙基硫代半乳糖苷（IPTG），3h小时后接入占发酵液体积20%的萃取剂，所述萃取剂为正十二烷；发酵过程中当糖浓度（°BX）下降到（4±1）%时开始补料，控制发酵液中糖浓度（°BX）在4.0±0.2。

所述糖蜜原液中的糖蜜为甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜两者的组合，甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜的重量比为2.5:6。

所述宿主细胞为大肠杆菌，重组宿主细胞为大肠杆菌B21，构建的重组宿主细胞大肠杆菌B21能够表达乙酰乙酰基CoA硫解酶（AtoB）、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶、法尼基焦磷酸合成酶和法尼烯合酶共9种酶；重组宿主细胞大肠杆菌B21，包含pKK223-3、PMCSG9、pMal-c4X三种质粒，其中pKK223-3上包含atoB、thmg1、mvd1三种基因，PMCSG9上包含erg13、erg12、erg8、ispA四种基因，pMal-c4X上包含idi、afs两种基因；所述质粒pKK223-3选用tac启动子、质粒PMCSG9选用T7启动子、质粒pMal-c4X选用tac启动子。

所述二级发酵摇瓶培养和30L发酵罐发酵培养过程中，培养基的主要组成如下：除杂纯化后的糖蜜占培养基比重12%，酵母粉8%、蛋白胨占培养基比重8.5%、柠檬酸铵占培养基比重4%、硫酸镁占培养基比重1.5%，硫酸锰占培养基比重0.4%，硫酸锌占培养基比重0.4%。

所述补料过程中补充的物料重量百分比为除杂纯化后的糖蜜60%，硫酸铵30%，蛋白胨10%，上述物料于110-120℃高压灭菌25-40min备用。

实施例4 一种气相色谱法检测发酵液中β-法尼烯的方法

一种气相色谱法检测发酵液中β-法尼烯的方法，包括如下步骤：

H1、发酵液前处理：取10mL以上发酵液，10000r/min离心5min，油相和水相分层，吸取上层油相，用0.44um有机滤膜过滤，得到滤出液；

H2、使用安捷伦7890A气相色谱仪，19091JHP-5色谱柱(柱长30m;内径0.32mm;膜厚250um)，配置β-法尼烯系列标准溶液，制成浓度分别为5g/L、10g/L、15g/L、20g/L的β-法尼烯标准溶液，分别进样检测，绘制线性回归方程，并计算R值，使R值在99%以上，上述β-法尼烯检测条件为：柱箱温度：初始温度70℃，保留2min，以10℃/min升至250℃,保留1min，进样口温度250℃，进样量1uL，品注入分流比1:50，检测器（FID）温度260℃，氮气作为载气，入口压力是15psi，模式为恒流模式。

采用本实施例中的种气相色谱法检测发酵液中β-法尼烯的方法对实施例1-3中生产的β-法尼烯进行检测，实施例1-3均发酵72h，，检测发酵液中β-法尼烯浓度依次达到20.5g/L、20.3g/L和20.2g/L。

上述具体实施方式仅是本发明的具体个案，本发明的专利保护范围包括但不限于上述具体实施方式的产品形态和式样，任何符合本发明权利要求书且任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化或修饰，皆应落入本发明的专利保护范围。

序列表

110 山东昆达生物科技有限公司 山东泓达生物科技有限公司

120 一种β-法尼烯的生产方法

160 12

170 SIPOSequenceListing 1.0

210 1

211 28

212 DNA

213 人工序列()

400 1

gacaattaat catcggctcg tataatgt 28

210 2

211 17

212 DNA

213 人工序列()

400 2

taatacgact cactata 17

210 3

211 29

212 DNA

213 人工序列()

400 3

tgacaattaa tcatcggctc gtataatgt 29

210 4

211 1185

212 DNA

213 人工序列()

400 4

atgaaaaatt gtgtcatcgt cagtgcggta cgtactgcta tcggtagttt taacggttca 60

ctcgcttcca ccagcgccat cgacctgggg gcgacagtaa ttaaagccgc cattgaacgt 120

gcaaaaatcg attcactaca cgttgatgaa gtgattatgg gtaacgtgtt gcaagccgga 180

ctggggcaaa atccggcacg tcaggcgctg ctaaaaagcg gactagctga aacggtgtgc 240

ggattcacgg tcaacaaagt gtgcggttca ggtctgaaaa gcgtggcgct tgctgcacag 300

gcgattcagg caggtcaggc acagagcatt gtggcggggg gtatggaaaa tatgagttta 360

gcgccctact tactcgatgc aaaagcacgc tctggttatc gtcttggaga cggacaggtt 420

tatgacgtaa tcctgcgcga tggcctgatg tgcgccaccc atggttatca tatggggatt 480

accgccgaaa acgtggctaa agagtacgga attacccgtg aaatgcagga tgaactggcg 540

ctacattcac agcgtaaagc ggcagccgca attgagtccg gtgcttttac agccgaaatc 600

gtcccggtaa atgttgtcac ccggaagaaa accttcgtct tcagtcaaga cgaattcccg 660

aaagcggatt ctacggctga agcgttaggc gcattgcgcc cggccttcga taaagcagga 720

acagtcaccg ccgggaacgc gtcaggtatt aacgacggtg ctgccgctct ggtgattatg 780

gaagaatctg cggcgctggc agcaggcctg aatcccctgg cacgcattaa aagttatgcc 840

agcggtggcg tgccccccgc attgatgggt atggggccag tacctgctac gcaaaaagcg 900

ttacaactgg cggggctgca actggcggat attgatctca ttgaggctaa tgaagcattt 960

gctgcacagt tccttgccgt tgggaaaacc ctgggctttg atcctgagaa agtgaatgtc 1020

aacggcgggg ccatcgcgct cggacatcct atcggtgcca gtggtgctcg tattctggtc 1080

acactattac atgcaatgca ggcacgcgat aaaacgctgg ggctggcaac actatgcatt 1140

ggtggcggcc agggaattgc gatggtgatt gagcggttga attaa 1185

210 5

211 1476

212 DNA

213 人工序列()

400 5

ttattttttt acatcgtaag atcttctaaa tttgtcatcg atgttggtca agtagtaaac 60

accactttgc aaatgctcaa tggaaccttg aggtttgaag ttcttcttca aatgggcatt 120

ttctctcaat tcgatggcag cttcgtaatc ctttggagtt tcggtgattc tcttggctaa 180

tttgttagta atatctaatt ccttgataat atgttggacg tcaccaacaa ttttgcaaga 240

atatagagat gcagctaaac cggaaccgta agaaaataaa ccaacacgct tgccttgtaa 300

gtcgtcagat ccaacatagt ttaatagaga tgcaaaggcg gcataaacag atgcggtgta 360

catgttacct gtgtttgttg gaacaatcaa agattgggca actctctctt tgtggaatgg 420

cttagcaaca ttaacaaaag ttttttcaat gttcttatcg gttaaagatt cgtcataatc 480

gcgagtagct aattcggcgt caacttctgg gaacaattga ggattggctc tgaaatcgtt 540

atatagtaat ctaccgtatg attttgtgac caatttacag gttggaacat ggaaaacgtt 600

gtagtcgaaa tatttcaaaa cgttcaaagc atccgaacca gcgggatcgc taaccaaccc 660

tttagaaata gccttcttgg aataactctt gtaaacttga tcaagagcct tgacgtaaca 720

agttaatgaa aaatgaccat cgacgtaagg atattcgctg gtgaaatctg gcttgtaaaa 780

atcgtaggcg tgttccatgt aagaagctct tacagagtca aatacaattg gagcatcagg 840

accgatccac atagcaacag taccggcacc accggttggt cttgcggcac ccttatcgta 900

gatggcaata tcaccgcaaa ctacaatggc gtctctacca tcccatgcgt tagattcaat 960

ccagttcaaa gagttgaaca acgcgttggt accaccgtaa caggcattaa gcgtgtcaat 1020

accttcgacg tcagtgtttt caccaaacaa ttgcatcaag acagacttga cagacttgga 1080

cttgtcaatc agagtttcag taccgacttc taatctacca attttgttag tgtcgatatt 1140

gtaactcttg atcaacttag acaaaacagt tagggacatc gagtagatat cttctctgtc 1200

attgacaaaa gacatgttgg tttggcccag accaattgtg tatttacctt gagaaacgcc 1260

atcaaatttc tctagctcag attggttgac acattgagtt gggatgtaaa tttggatacc 1320

tttaataccg acattttgag gtctggtttt ttgttcagcg gtcttttgtt tttttagttc 1380

agtcatttgc aagtttgtat tgtgtaattg ttgttgcttt tgcggcctaa gtcttccctt 1440

aataccacac caacaaagtt tagttgagag tttcat 1476

210 6

211 381

212 DNA

213 人工序列()

400 6

atgtcagact gcggagcgcg ccccaaaaaa cccatgagcg ccttcatgtt gtggatgaat 60

tccaccgggc ggaagcacat aaaagcggag catcccgatt ttagtgtcca agaagtgtct 120

gtgaagggcg gagagatgtg gcgagccatg gccgatgagg acaagatcgt gtggcaggag 180

tcggccacca cggcaatggc cgagtacaag gagaagttga agcagtggaa tttccccaag 240

gagcaccgct tttcggacac gcaatgtatt tgttcctcaa atactaacca atgccccacc 300

ctttttgtgt acgacaccat ggatgactcg atgactccga tctgcaggaa gtgcttatca 360

aagaccaggt gccttcacta a 381

210 7

211 1332

212 DNA

213 人工序列()

400 7

atgtcattac cgttcttaac ttctgcaccg ggaaaggtta ttatttttgg tgaacactct 60

gctgtgtaca acaagcctgc cgtcgctgct agtgtgtctg cgttgagaac ctacctgcta 120

ataagcgagt catctgcacc agatactatt gaattggact tcccggacat tagctttaat 180

cataagtggt ccatcaatga tttcaatgcc atcaccgagg atcaagtaaa ctctcaaaaa 240

ttggccaagg ctcaacaagc caccgatggc ttgtctcagg aactcgttag tcttttggat 300

ccgttgttag ctcaactatc cgaatccttc cactaccatg cagcgttttg tttcctgtat 360

atgtttgttt gcctatgccc ccatgccaag aatattaagt tttctttaaa gtctacttta 420

cccatcggtg ctgggttggg ctcaagcgcc tctatttctg tatcactggc cttagctatg 480

gcctacttgg gggggttaat aggatctaat gacttggaaa agctgtcaga aaacgataag 540

catatagtga atcaatgggc cttcataggt gaaaagtgta ttcacggtac cccttcagga 600

atagataacg ctgtggccac ttatggtaat gccctgctat ttgaaaaaga ctcacataat 660

ggaacaataa acacaaacaa ttttaagttc ttagatgatt tcccagccat tccaatgatc 720

ctaacctata ctagaattcc aaggtctaca aaagatcttg ttgctcgcgt tcgtgtgttg 780

gtcaccgaga aatttcctga agttatgaag ccaattctag atgccatggg tgaatgtgcc 840

ctacaaggct tagagatcat gactaagtta agtaaatgta aaggcaccga tgacgaggct 900

gtagaaacta ataatgaact gtatgaacaa ctattggaat tgataagaat aaatcatgga 960

ctgcttgtct caatcggtgt ttctcatcct ggattagaac ttattaaaaa tctgagcgat 1020

gatttgagaa ttggctccac aaaacttacc ggtgctggtg gcggcggttg ctctttgact 1080

ttgttacgaa gagacattac tcaagagcaa attgacagtt tcaaaaagaa attgcaagat 1140

gattttagtt acgagacatt tgaaacagac ttgggtggga ctggctgctg tttgttaagc 1200

gcaaaaaatt tgaataaaga tcctaaaatc aaatccctag tattccaatt atttgaaaat 1260

aaaactacca caaagcaaca aattgacgat ctattattgc caggaaacac aaatttacca 1320

tggacttcat aa 1332

210 8

211 1356

212 DNA

213 人工序列()

400 8

atgtcagagt tgagagcctt cagtgcccca gggaaagcgt tactagctgg tggatattta 60

gttttagata caaaatatga agcatttgta gtcggattat cggcaagaat gcatgctgta 120

gcccatcctt acggttcatt gcaagggtct gataagtttg aagtgcgtgt gaaaagtaaa 180

caatttaaag atggggagtg gctgtaccat ataagtccta aaagtggctt cattcctgtt 240

tcgataggcg gatctaagaa ccctttcatt gaaaaagtta tcgctaacgt atttagctac 300

tttaaaccta acatggacga ctactgcaat agaaacttgt tcgttattga tattttctct 360

gatgatgcct accattctca ggaggatagc gttaccgaac atcgtggcaa cagaagattg 420

agttttcatt cgcacagaat tgaagaagtt cccaaaacag ggctgggctc ctcggcaggt 480

ttagtcacag ttttaactac agctttggcc tccttttttg tatcggacct ggaaaataat 540

gtagacaaat atagagaagt tattcataat ttagcacaag ttgctcattg tcaagctcag 600

ggtaaaattg gaagcgggtt tgatgtagcg gcggcagcat atggatctat cagatataga 660

agattcccac ccgcattaat ctctaatttg ccagatattg gaagtgctac ttacggcagt 720

aaactggcgc atttggttga tgaagaagac tggaatatta cgattaaaag taaccattta 780

ccttcgggat taactttatg gatgggcgat attaagaatg gttcagaaac agtaaaactg 840

gtccagaagg taaaaaattg gtatgattcg catatgccag aaagcttgaa aatatataca 900

gaactcgatc atgcaaattc tagatttatg gatggactat ctaaactaga tcgcttacac 960

gagactcatg acgattacag cgatcagata tttgagtctc ttgagaggaa tgactgtacc 1020

tgtcaaaagt atcctgaaat cacagaagtt agagatgcag ttgccacaat tagacgttcc 1080

tttagaaaaa taactaaaga atctggtgcc gatatcgaac ctcccgtaca aactagctta 1140

ttggatgatt gccagacctt aaaaggagtt cttacttgct taatacctgg tgctggtggt 1200

tatgacgcca ttgcagtgat tactaagcaa gatgttgatc ttagggctca aaccgctaat 1260

gacaaaagat tttctaaggt tcaatggctg gatgtaactc aggctgactg gggtgttagg 1320

aaagaaaaag atccggaaac ttatcttgat aaataa 1356

210 9

211 1191

212 DNA

213 人工序列()

400 9

atgaccgttt acacagcatc cgttaccgca cccgtcaaca tcgcaaccct taagtattgg 60

gggaaaaggg acacgaagtt gaatctgccc accaattcgt ccatatcagt gactttatcg 120

caagatgacc tcagaacgtt aacctctgcg gctactgcac ctgagtttga acgcgacact 180

ttgtggttaa atggagaacc acacagcatc gacaatgaaa gaactcaaaa ttgtctgcgc 240

gacctacgcc aattaagaaa ggaaatggaa tcgaaggacg cctcattgcc cacattatct 300

caatggaaac ttcacattgt ctccgaaaat aactttccta cagcagctgg tttagcttcc 360

tccgctgctg gctttgctgc attggtctct gcaattgcta agttatacca attaccacag 420

tcaacttcag aaatatctag aatagcaaga aaggggtctg gttcagcttg tagatcgttg 480

tttggcggat acgtggcctg ggaaatggga aaagctgaag atggtcatga ttccatggca 540

gtacaaatcg cagacagctc taactggcct cagatgaaag cttgtgtcct agttgtcagc 600

gatattaaaa aggatgtgag ttccactcag ggtatgcaat tgaccgtggc aacctccgaa 660

ctatttaaag aaagaattga acatgtcgta ccaaagagat ttgaagtcat gcgtaaagcc 720

attgttgaaa aagatttcgc cacctttgca aaggaaacaa tgatggattc caactctttc 780

catgccacat gtttggactc tttccctcca atattctaca tgaacgacac ttccaagcgt 840

atcatcagtt ggtgccacac cattaatcag ttttacggag aaacaatcgt tgcatacacg 900

tttgatgcag gtccaaatgc tgtgttgtac tacttagctg aaaatgagtc gaaactcttt 960

gcatttatct ataaattgtt tggctctgtt cctggatggg acaagaaatt tactgctgag 1020

cagcttgagg ctttcaacca tcaatttgaa tcttctaact ttactgcacg tgaattggat 1080

cttgagttgc aaaagggtgt tgccagagtg attttaactc aagtcggttc aggcccacaa 1140

gaaacaaatg aatctttgat tgacgcaaag actggtctac caaagaaata a 1191

210 10

211 549

212 DNA

213 人工序列()

400 10

atgcaaacgg aacacgtcat tttattgaat gcacagggag ttcccacggg tacgctggaa 60

aagtatgccg cacacacggc agacaccctc ttacatctcg cgttttccag ttggctgttt 120

aatgccaaag ggcaattatt agttacccgc cgcgccctta gcaaaaaagc atggcctggc 180

gtgtggacta actcggtttg tgggcaccca caactgggag aaagcaacga agaggcggtg 240

atccgccgtt gccgttatga gcttggcgta gaaattacgc ctcctgaatc tatctatcct 300

gactttcgct accgcgccac cgatccgaat ggcattgtgg aaaatgaagt gtgtccggta 360

tttgccgcac gcacgaccag tgcgttacag atcaacgatg atgaagtgat ggattatcaa 420

tggtgtgatt tagcagcggt tttacgcggt attgatgcta cgccgtgggc gttcagtccg 480

tggatggtga tgcaggcgac aaatcgcgaa gccagaaaac gattatctgc atttacccaa 540

cttaaataa 549

210 11

211 543

212 DNA

213 人工序列()

400 11

atgggggaca ccgtttgcaa tgggacaccc tgcaaaaagg cgtcgctctc ggactctcag 60

ctgtttgacg ccaagttcga ggagctggtg acagagctga ccgagaggga cctccaggat 120

cctgcgctgg cggacgcctt gaaaaggttg agagaggttt tggattacaa tgttcctgga 180

ggcaaaaaga acagaggttt gtctgtgatt ggctccctga gggagcttct tccgccgtcc 240

cagctcagtc aggatgctgt gcagaaagct ctgacggtcg gctggtgcat agagatgctt 300

caagcatttt tcctcatggc ggatgacatc atggatgcat ctgtgacccg gcgaggtcaa 360

ccctgctggt acaagaggaa tggaataggt ctggatgcaa taaatgactc cttcttgtgg 420

aggcatcaat atatagactc cttcgaaggc aatgcagggg tgagccgtat tacgtccatt 480

tactggagct ttttaatgag tccaccttcc agactgaact tggtcaggcc ctggacctca 540

tga 543

210 12

211 1731

212 DNA

213 人工序列()

400 12

atggaattca gagttcactt gcaagctgat aatgagcaga aaatttttca aaaccagatg 60

aaacccgaac ctgaagcctc ttacttgatt aatcaaagac ggtctgcaaa ttacaagcca 120

aatatttgga agaacgattt cctagatcaa tctcttatca gcaaatacga tggagatgag 180

tatcggaagc tgtctgagaa gttaatagaa gaagttaaga tttatatatc tgctgaaaca 240

atggatttag tagctaagtt ggagctcatt gacagcgtcc gaaaactagg cctcgcgaac 300

ctcttcgaaa aggaaatcaa ggaagcccta gacagcattg cagctatcga aagcgacaat 360

ctcggcacaa gagacgatct ctatggtact gcattacact tcaagatcct caggcagcat 420

ggctataaag tttcacaaga tatatttggt agattcatgg atgaaaaggg cacattagag 480

aaccgccatt tcgcacattt gaaaggaatg ctggaacttt tcgaggcctc aaacctgggt 540

ttcgaaggtg aagatatttt agatgaggcg aaagcttcct tgacgctagc tctcagagat 600

agtggtcata tttgttatcc ggacagtaac ctttccaggg acgtaattca ttccctggag 660

cttccatcac accgcagagt gcagtggttt gatgtcaaat ggcaaatcaa cgcctatgaa 720

aaagacatct gtcgcgtcaa cgccacgtta ctcgaattag caaagcttaa tttcaacatg 780

gttcaggccc acctccaaaa agacttaagg gaagcatcca agtggtgggc aaatctgggc 840

atcgcagaca acttgaaatt tgcaagagat agactggttg aatgtttcgc atgtgctgtg 900

ggagtagctt tcgagcctga atactcatct tttagaatat gtcttaccaa agtcatcaac 960

ttagtactga tcatagacga cgtctatgat atttatggct cagaggaaga gctaaagcac 1020

ttcaccaatg ctgttgatag gtgggattct agggaaactg agcagcttcc agagtgtatg 1080

aagatgtgtt tccaagtact ctacaacact acttgtgaaa ttgctcatga aattgagaag 1140

gacaatggtt ggaaccaagt attacctcaa ttgaccaaag tgtgggcaga tttttgtaaa 1200

gcattattgg tggaggcaga gtggtataat aagagccata taccaaccct tgaagagtac 1260

ctaagaaatg gatgcgattc atcatcagtt tcaatacttt tggttcactc atttttctct 1320

ataactcatg agggaaccaa agagatggct gattttcttc acaagaatga agatcttttg 1380

tataatctct ctctcattgt tcgcctcaac aatgatttgg gaacttctgc ggctgaacaa 1440

gagagagggg attctccttc atcaatcgta tgttacatga gagaagtgaa tgcctctgaa 1500

gaaatagcta ggaagaacat taagggcatg atagacaatg catggaagaa agtaaatgga 1560

aaatgcttca caacaaacca agtgcctttt ctgtcatcat tcatgaacaa tgccacaaac 1620

atggcacgtg tggcgcacag cctttacaaa gacggagatg ggtttggtga ccaagagaaa 1680

gggcctcgga cccacatcct atctttacta ttccaacctc ttgtaaacta g 1731